Закончив учебу в строгой школе Гудимеля, Палестрина в 1544 году стал органистом и капельмейстером при соборе в Палестрине. Спустя 6 лет он занял должность преподавателя музыки в Ватиканской капелле, а затем стал ее капельмейстером. Папа Марчелло II оказался снисходительным к Палестрине, благодаря чему последнего вскоре пригласили в члены певческой коллегии папской капеллы.

После смерти Марчелло II папский престол занял Павел I V, прослывший человеком весьма строгих правил. Палестрине, как человеку неженатому и лицу недуховному, сначала было предписано покинуть папскую капеллу, но затем ему предложили должность капельмейстера в римской церкви Святого Джованни, где он проработал около шести лет, а затем перешел на аналогичную службу в церковь Санта-Мария Маджоре.

Несмотря на большую занятость, Палестрина умудрялся выделять время для занятий композицией. Так, к 1560 году он написал несколько импроперий - псалмов, поющихся на Страстной неделе, привлекавших внимание широкой публики своей простой, красивой и гармоничной музыкой.

Вскоре после этого Палестрина получил заказ от Тридентского собора (1543 - 1563) на сочинение пробной мессы, которая доказала бы возможность сохранения контрапункта в церковной музыке. Дело в том, что несколько ранее на Тридентском соборе, стремившемся очистить католицизм от всяких элементов протестантизма, предложили исключить из церковной музыки контрапункт и возвратиться к одноголосному григорианскому пению. Считалось, что многоголосная музыка из-за контрапунктических сплетений оттесняет текст на второй план, при этом нарушает и музыкальное благозвучие произведения. Чтобы разрешить спор, разгоревшийся вслед за этим предложением между присутствующими на Тридентском соборе, была избрана специальная комиссия, в обязанность которой вменялось определить, возможно ли при вышеизложенном требовании духовенства сохранить в церковной музыке контрапунктический стиль. С этой целью комиссия и поручила Палестрине создать контрапунктическую мессу, отвечавшую также и выдвинутым на соборе притязаниям.

Понимая, насколько важной является просьба Тридентского собора, композитор создал 3 шестиголосные мессы, которые решили участь контрапунктической музыки. Папа Пий IV отозвался о произведениях Палестрины следующим образом: «Здесь Иоанн (т. е. Палестрина) в земном Иерусалиме дает нам предчувствие того пения, которое святой апостол Иоанн в пророческом экстазе слышал в небесном Иерусалиме».

Влияние, оказанное мессами на духовенство, было настолько сильным, что выступления против использования в церковной музыке контрапункта прекратились. Кроме того, Тридентский собор постановил за правило всем композиторам духовной музыки писать в стиле Палестрины.

Творчество Джованни Пьерлуиджи Палестрины ознаменовало собой вершину развития контрапунктической духовной музыки a capella. В его произведениях контрапунктического стиля всевозможные комбинации сочетаются с ясностью текста.

Лучшими сочинениями его является сборник четырех- и пятиголосных месс, а также упомянутые выше шестиголосные мессы. Кроме того, композитор написал 14 книг четырех-, пяти- и шестиголосных месс; 1 книгу восьмиголосных; 10 книг четырех-, пятиголосных мотетов; 1 книгу офферториев; 3 книги литаний; 1 книгу пяти-, шести- и восьмиголосных магнификатов; 3 книги ламентаций; 4 книги четырех- и пятиголосных мадригалов.

Палестрине вместе с композитором Джованни Мария Нанино принадлежит заслуга в основании в Риме музыкальной школы, которая в свое время выпустила немало хороших музыкантов.

Умер Палестрина в 1594 году в Риме.

Другим выдающимся музыкантом эпохи Высокого Возрождения является Орландо Лассо (настоящее имя Ролан де Лассю), появившийся на свет около 1532 года в Монсе, близ Геннегау (Бельгия).